細胞培養基

一、常用的細胞培養基介紹

1. BME培養基，基礎 Eagle 培養基（basal medium eagle)

BME培養基是一種廣泛使用的合成基礎培養基，可支持很多種類(lèi)的哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)。BME 最初由 Harry Eagle 針對 HeLa 細胞和小鼠成纖維細胞開(kāi)發(fā)，其發(fā)現了體外細胞生長(cháng)的zui 低要求。BME 不含蛋白、脂類(lèi)或生長(cháng)因子。因此，BME 需要添加劑。

2. MEM培養基（Minimum Eagle's Medium）

MEM培養基是所有培養基中zui常用的一種，可用于多種懸浮和貼壁生長(cháng)的哺乳動(dòng)物細胞，包括 HeLa、BHK-21、293、HEP-2、HT-1080、MCF-7、成纖維細胞和原代大鼠星形膠質(zhì)細胞。

3. DMEM培養基，Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）

DMEM培養基是一種廣泛使用的基礎培養基，可用于支持很多種類(lèi)的哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)。已經(jīng)在 DMEM 中培養成功的細胞包括原代成纖維細胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、HUVEC、平滑肌細胞，以及 HeLa、293、Cos-7 和 PC-12 等細胞系。

4. IMDM培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）

IMDM培養基是一種高度富集的合成培養基，非常適用于快速增殖的高密度細胞培養，包括 Jurkat、COS-7 和巨噬細胞。

5. RPMI-1640培養基（Roswell Park Memorial Institute 1640）

RPMI-1640 培養基被發(fā)現適用于多種哺乳動(dòng)物細胞，包括 HeLa 細胞、Jurkat 細胞、 MCF-7 細胞、PC12 細胞、PBMC 細胞、星形膠質(zhì)細胞和癌細胞。RPMI 1640 培養基相比其他培養基之所以具有*的效果，是因為其中含有還原劑谷胱甘肽和高濃度的維生素。RPMI 1640 培養基含有生物素、 維生素 B12 以及 PABA，這些成分是 Eagle’s MEM 和DMEM所不具備的。

6. M199培養基（Medium 199）

199 培養基最初配方用于雞胚成纖維細胞的營(yíng)養研究。199 培養基由 Earle’s 平衡鹽或 Hanks’ 平衡鹽配制而成。由 Earle’s 平衡鹽配制而成的培養基使用碳酸氫鹽/碳酸系統緩沖液，并在 CO2培養箱中保持 pH 值。 在大氣條件下使用 Earle’s 平衡鹽會(huì )導致培養基 pH 值迅速升高。由 Hanks’ 平衡鹽配制而成的 199 培養基使用專(zhuān)為大氣平衡設計的專(zhuān)用鹽溶液進(jìn)行緩沖，在CO2 培養箱中使用會(huì )令培養基 pH 值迅速下降。

7. McCoy's 5A（改良）培養基（McCoy's 5A (Modified) Medium）

McCoy's 5 A （改良）培養基是一種通用培養基，可支持多種類(lèi)型原代細胞、成熟細胞系以及活檢組織塊的增殖。這種培養基可支持源自正常骨髓、皮膚、脾臟、腎臟、肺、大鼠胚胎及其他組織的原代哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)。Thomas McCoy 博士起初將 McCoy's5 A 培養基配制為基礎培養基 5 A 的改良版本。與其他培養基不同，McCoy's5 A 包含還原劑谷胱甘肽、細菌蛋白胨和高濃度葡萄糖。McCoy's 5A（改良）培養基使用碳酸氫鈉緩沖體系 (2.2 g/L)，因此需要 5–10% CO2 的環(huán)境來(lái)維持生理 pH 值。

8. Ham's F-12營(yíng)養培養基

Ham's F-12 營(yíng)養混合物 (F-12) 起初設計用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞的無(wú)血清單細胞鋪板。自此之后，F-12 已用于 CHO 培養物的無(wú)血清生長(cháng)以及其他哺乳動(dòng)物細胞的添加血清生長(cháng)，包括軟骨細胞和大鼠前列腺上皮細胞。與其他基礎培養基相比，F-12 含有更廣泛的成分，包括鋅、腐胺、Hypoxanthine和胸苷。CHO 細胞在 F-12 中的無(wú)血清生長(cháng)催生了各種改良配方。

9. Leibovitz L15培養基

Leibovitz L-15 培養基支持 HEP-2 猴腎臟細胞以及胚胎和成人組織的原代組織塊生長(cháng)。L-15 采用磷酸鹽和游離氨基酸而非碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖。這種培養基適用于支持非 CO2 平衡環(huán)境中的細胞生長(cháng)。L-15 不含蛋白、脂質(zhì)或生長(cháng)因子。

10. Neurobasal培養基

Neurobasal 培養基是一種基礎培養基，設計用于純產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元細胞群的長(cháng)期維持和成熟，在與 Gibco B-27 補充劑配合使用時(shí)無(wú)需星形膠質(zhì)細胞滋養層。Neurobasal 培養基適用于大多數神經(jīng)元細胞應用。

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二、常用的細胞培養基配套試劑(緩沖液、平衡鹽溶液等)

1、無(wú)鈣、鎂、離子溶液(1000ml)

氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫鈉、(NaH2PO4H20)0.05g、Potassium chloride (KCl)0.2g、碳酸氫鈉(NaHCO3)1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL

2、PBS(Phosphate-Buffered saline)磷酸鹽緩沖液

甲液:0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉(無(wú)水)28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL

乙液:0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉(無(wú)水)2.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL

甲、乙液于4℃保存，使用時(shí)按表3-2所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。

3、Hanks液(HBSSHank's Balanced salt solution)

⑴母液甲(20x)配法

①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O(A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質(zhì)溶后再加后一種。

②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時(shí)不斷攪拌(此液應單配，單溶)。

待上述兩溶液中的"溶質(zhì)"全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。

⑵母液乙(20×)配法

①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶于800ml雙蒸水中。

②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過(guò)濾，pH為7.4，4℃保存。

待上述各"溶質(zhì)"*溶解后，用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。

3)使用液(1×)配法

取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標志。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞)，置室溫后4℃保存，可使用幾個(gè)月。臨用前，用7.5%NaHCO3調至所需pH。

4、Eagle's液(EBSSEagle's Balanced salt solution)

是一種在二氧化碳(CO2)環(huán)境中短期維持細胞活性的平衡鹽溶液，可用于細胞解離前的清洗、細胞或組織的運輸、細胞計數時(shí)稀釋、溶液的配置等。

5、HEPES液

生物緩沖液，化學(xué)性質(zhì)穩定，在PH7.2~7.6范圍內，比NaHCO3緩沖液的緩沖能力更強。

6、NaHCO3緩沖液

常規緩沖體系的一部分，但是不穩定，易受空氣中CO2的含量而改變PH值，影響緩沖效果。

三、相關(guān)細胞培養知識

細胞培養也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規名詞為細胞培養技術(shù)。細胞培養是指從動(dòng)物活體體內取出組織，于模擬體內生理環(huán)境等特定的體內條件下，進(jìn)行孵育培養，使之生存并生長(cháng)。細胞培養現已廣泛應用于生物學(xué)、醫學(xué)、新藥研發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域。通過(guò)細胞培養得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。細胞的生長(cháng)需要營(yíng)養環(huán)境，用于維持細胞生長(cháng)的營(yíng)養基質(zhì)稱(chēng)為培養基。培養基按其物理狀態(tài)可分為液體培養基和固體培養基。

根據細胞生長(cháng)的恃點(diǎn)，需要選擇不同方法進(jìn)行細胞傳代：

◆ 貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長(cháng)（半懸浮生長(cháng)）的細胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長(cháng)的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

1.  貼壁細胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶?jì)扰f培養液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶?jì)燃尤脒m量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面。（注意：胰蛋白酶要預溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5 min 后把培養瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數毫升，輕輕轉動(dòng)培養瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶?jì)扰囵B液，反復吹打瓶壁細胞。從培養瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)猛。

7） 細胞計數后分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

8）置于37℃細胞培養箱培養。（注意：要定時(shí)觀(guān)察細胞，如發(fā)現污染，應及時(shí)處理。）

2.  懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細胞連同培養液一并轉移到15 ml 離心管內。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉速要合適。轉速過(guò)低，不能有效分離細胞；離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(cháng)，會(huì )擠壓細胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打形成細胞懸液。

4） 計數，分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

直接傳代法：讓?xiě)腋〖毎恋碓谄康缀?，將上清液吸?/2~2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細胞，如Hela細胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。

2）對絕大部分貼壁生長(cháng)的細胞，因直接吹打對細胞損傷較大，細胞常有較大數量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。