細胞培養

一、產(chǎn)品介紹

細胞培養也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規名詞為細胞培養技術(shù)。通過(guò)細胞培養得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。細胞的生長(cháng)需要營(yíng)養環(huán)境，用于維持細胞生長(cháng)的營(yíng)養基質(zhì)稱(chēng)為培養基。培養基按其物理狀態(tài)可分為液體培養基和固體培養基。

細胞培養是指從動(dòng)物活體體內取出組織，于模擬體內生理環(huán)境等特定的體內條件下，進(jìn)行孵育培養，使之生存并生長(cháng)。細胞培養現已廣泛應用于生物學(xué)、醫學(xué)、新藥研發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域。

二、過(guò)程介紹

細胞培養過(guò)程中，涉及到多個(gè)基本實(shí)驗操作，例如：復蘇、換液、傳代、凍存等。

復蘇

1.把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)(注意防止蓋子不緊致使液體進(jìn)入凍存管)。液體都融化后(大概1-1.5分鐘)，拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺里。

2.把上述細胞懸液吸到裝10ml培養基的15ml的離心管中(用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來(lái))，1000轉離心5分鐘。

3.把上清液倒掉，加1ml培養基把細胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養基的10cm培養皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養皿中的細胞均勻分布。

4.標好細胞種類(lèi)和日期、培養人名字等，放到37℃的5%CO2培養箱中培養。

5.根據細胞增長(cháng)速度2-3天換一次培養基。

換液（以貼壁細胞為例）

1.培養一段時(shí)間后，細胞還未長(cháng)滿(mǎn)，而細胞培養基顏色由紅色逐漸變黃，說(shuō)明培養基中營(yíng)養物質(zhì)不足，需要及時(shí)換液。

2.吸掉原有培養基。

3.加入等體積新的*培養基。

4.放到37℃的5%CO2培養箱中繼續培養。

5.培養過(guò)程中，要定期觀(guān)察細胞狀態(tài)。如果細胞密度達到80%-90%需要準備傳代。

傳代（以貼壁細胞為例）

1.培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時(shí)要傳代。

2.把原有培養基吸掉。

3.加適當的胰蛋白酶(能覆蓋細胞就行)，消化1-2分鐘。

4.細胞都變圓后加入等體積的含血清的培養基終止消化。

5.用移液槍吹打細胞，讓細胞懸浮起來(lái)。

6.把細胞吸到10ml或15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘。

7.倒掉上清液，加1-2ml培養基，把細胞都吹起來(lái)。

8.根據細胞種類(lèi)把細胞傳到幾個(gè)培養皿中，一般1: 2~3傳代。

凍存

把細胞消化下來(lái)并離心(同上)。用配好的凍存液把細胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫(xiě)明細胞種類(lèi)，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃ 過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存。

凍存液的配制:80%的*培養基+10?S+10%DMSO。注意：DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

三、根據細胞生長(cháng)的恃點(diǎn)，需要選擇不同方法進(jìn)行細胞傳代

◆ 貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長(cháng)（半懸浮生長(cháng)）的細胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長(cháng)的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

1.  貼壁細胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶?jì)扰f培養液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶?jì)燃尤脒m量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面。（注意：胰蛋白酶要預溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5 min 后把培養瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數毫升，輕輕轉動(dòng)培養瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶?jì)扰囵B液，反復吹打瓶壁細胞。從培養瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)猛。

7） 細胞計數后分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

8）置于37℃細胞培養箱培養。（注意：要定時(shí)觀(guān)察細胞，如發(fā)現污染，應及時(shí)處理。）

2.  懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細胞連同培養液一并轉移到15 ml 離心管內。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉速要合適。轉速過(guò)低，不能有效分離細胞；離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(cháng)，會(huì )擠壓細胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打形成細胞懸液。

4） 計數，分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

直接傳代法：讓?xiě)腋〖毎恋碓谄康缀?，將上清液吸?/2~2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細胞，如Hela細胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。

2）對絕大部分貼壁生長(cháng)的細胞，因直接吹打對細胞損傷較大，細胞常有較大數量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。

四、細胞培養優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1）能長(cháng)期傳代，保持活性，便于監控檢測結構功能和生命活動(dòng)。

2）培養條件可以人為的控制便于研究細胞代謝、物理、化學(xué)、生物因素的影響

3）可用于各種觀(guān)察和檢測手段研究活細胞的變化(變異、分化)?？蓮募毎介_(kāi)展亞細胞結構和代謝分子的表達。

4）研究范圍和細胞來(lái)源廣泛，選擇性廣。

5）不同代次細胞可長(cháng)期保存，既可開(kāi)展同代次不同條件和方法研究，又可觀(guān)察不同代次的動(dòng)態(tài)變化。

6）耗資少、經(jīng)濟、成本低、可大量培養，利于生物制品的生產(chǎn)。

缺點(diǎn)：

細胞或組織生長(cháng)在人工環(huán)境中，與體內環(huán)境存在差異，細胞或組織的形態(tài)或功能會(huì )發(fā)生不同程度的改變。