RNA pull down實(shí)驗技術(shù)

RNA pull down實(shí)驗技術(shù)

1. 實(shí)驗原理

RNA pull down是體外研究RNA與蛋白互作的重要技術(shù)。該技術(shù)是用生物素標記體外轉錄的靶RNA分子，再用鏈霉親和素純化出與靶RNA結合的蛋白復合體，洗脫得到RNA結合蛋白質(zhì)。再通過(guò)western blot實(shí)驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與靶RNA結合；或通過(guò)質(zhì)譜儀檢測可以篩選出與靶RNA結合的蛋白。

生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價(jià)作用；其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。因此用生物素標記核酸后，可以純化出與該核酸結合的各種生物大分子復合物。

2. 實(shí)驗流程

1）探針設計及標記：體外轉錄或合成獲取RNA，生物素標記;

2）pull down：與細胞裂解液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復合物。該復合物可與鏈霉親和素磁珠結合，從而把靶RNA結合蛋白從細胞裂解液中分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)洗滌將非特異性結合蛋白質(zhì)去除；最后，洗脫得到與靶RNA結合的蛋白質(zhì)復合物；

3）互作蛋白質(zhì)鑒定：再經(jīng)過(guò)Western Blot（WB）或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。

3. 服務(wù)內容

1）體外轉錄或合成RNA，生物素標記；

2）細胞培養與細胞裂解液制備；

3）pull down捕獲互作蛋白；

4）Western blot驗證互作蛋白；

5）MS篩選鑒定互作蛋白。

4. 交付結果

1）提供詳細、完整的實(shí)驗報告；

2）客觀(guān)公正的原始數據和實(shí)驗分析結果。

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