細胞凋亡檢測基于形態(tài)學(xué)的方法要怎么操作？

　　凋亡或者說(shuō)程序性細胞死亡，是細胞內建的防御機制之一，在生物的正常發(fā)育及疾病抵御中起到重要的作用。凋亡過(guò)程與通路的異常，會(huì )導致多種疾病，包括腫瘤。目前至少有十數種檢測細胞凋亡的方法，從大框架上講，可以劃分為基于細胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標記三大類(lèi)。那么細胞凋亡檢測基于形態(tài)學(xué)的方法是怎么操作的呢？

　　

　　1、電子顯微鏡檢查

　　

　　“凋亡”是一個(gè)細胞形態(tài)學(xué)概念。因此，鑒定凋亡的金指標，往往是基于形態(tài)學(xué)的。凋亡和另外一種主要的細胞死亡類(lèi)型“壞死”有著(zhù)顯著(zhù)的亞細胞形態(tài)差異。簡(jiǎn)而言之，在透射電鏡下，凋亡細胞染色質(zhì)濃聚，通常沿核膜分布；整體細胞形態(tài)發(fā)生變化，如細胞表面微絨毛狀突起消失，細胞間接觸消失，細胞質(zhì)濃聚，形成具有膜結構的包裹著(zhù)胞漿內容物和核物質(zhì)的凋亡小體；相比壞死，凋亡細胞的核結構直到晚期才會(huì )解體。

　　

　　盡管電鏡檢查是細胞凋亡檢測的金標準，然而其缺點(diǎn)也很明顯：無(wú)法定量（電鏡一個(gè)視野僅能觀(guān)察一兩個(gè)細胞），實(shí)驗步驟繁瑣（固定、切片到拍照），同時(shí)，并非所有實(shí)驗室都能接觸到電鏡。因此，對于不專(zhuān)門(mén)研究凋亡這種細胞現象的實(shí)驗室來(lái)說(shuō)，基本沒(méi)有人選擇電鏡來(lái)檢測凋亡了。好在目前的主流期刊，也是接受不含電鏡的凋亡數據。

　　

　　2、細胞核形態(tài)染色

　　

　　既然凋亡細胞其中一個(gè)形態(tài)學(xué)特征是染色質(zhì)濃聚，且細胞核結構在凋亡后期崩解，那么觀(guān)察核形態(tài)也是較為直接的指標。相比其他形態(tài)學(xué)指標來(lái)說(shuō)，觀(guān)察細胞核形態(tài)不需要電子顯微鏡，而只需用熒光染料配合普通的熒光顯微鏡即可。

　　

　　一般而言，核形態(tài)染色采用的是DAPI和Hoechst系列熒光染料。因為這些染料特異性強，熒光性能好。其中，Hoechst33342是最為方便的染料。它可自由穿透細胞膜，直接對核染色，而不需要固定、破膜步驟。因此，Hoechst33342還能結合形態(tài)學(xué)的相差圖像，以及其他活細胞染料（如用7-AAD等染細胞膜破裂的細胞），同時(shí)對多個(gè)指標進(jìn)行定量。

　　

　　除了實(shí)驗操作簡(jiǎn)單、成本低廉之外，核形態(tài)染色的優(yōu)勢還在于它是一個(gè)定量指標。因此，這也是我常用的細胞凋亡檢測指標之一。不過(guò)，定量依賴(lài)于拍攝照片后對多個(gè)視野的不同核形態(tài)手動(dòng)計數。